KULTUR JARINGAN

I.     PENDAHULUAN

1.1     Latar Belakang Pembuatan Bibit Secara Kultur Jaringan

Atas dasar teori dari Schleiden dan Schwann yang menyatakan bahwa tiap-tiap sel mampu tumbuh menjadi tanaman baru, maka diperoleh kemampuan ini yang disebut totipotensi dari sel. Dengan teori tersebut banyak dikembangkan tanaman baru yang berasal dari jaringan tumbuhan tertentu. Reproduksi tanaman dengan menggunakan jaringan tertentu tersebut disebut dengan kultur jaringan (tissue culture). Teknik ini dipopulerkan oleh Muer, Haberlant, dan Riker pada tahun 1954.

Kultur jaringan telah banyak diterapkan dalam bidang pertanian dan perkebunan dalam skala besar untuk mendapatkan bibit unggul dalam waktu yang singkat. Kultur jaringan dilakukan di dalam laboratorium dengan cara menumbuhkan sel atau jaringan tumbuhan/hewan di dalam medium buatan. Teknik ini mudah diterapkan pada tumbuhan dibandingan dengan hewan. Hal tersebut dikarenakan sel tumbuhan memiliki sifat totipotensi yang tinggi dibandingan dengan sel hewan. Dalam kultur jaringan ini hanya diperlukan sedikit bagian dari tumbuhan atau hewan, misalnya tunas, akar, atau daun. Bagian tersebut dibagi-bagi lagi dan setiap bagian ditumbuhkan dalam medium tertentu dan kondisi steril di laboratorium. Hasilnya nanti adalah organisme dalam jumlah besar dan mempunyai sifat yang sama dengan induknya (Anonymousª, 2013).

Kultur jaringan dapat memperbanyak tanaman dengan sifat seperti induknya, pembiakan ini termasuk pembiakan secara vegetatif, yaitu individu baru terjadi dari bagian tubuh suatu induk. Oleh karena itu, individu yang baru terbentuk mempunyai sifat yang sama dengan induknya. Perbanyakan tanaman dengan teknik ini membuat tanaman bebas dari penyakit karena dilakukan secara aseptik. Penggunaan metode ini sangat ekonomis dan komersial karena bahan tanaman awal yang diperlukan hanya sedikit atau satu bagian kecil yang menghasilkan turunan dalam jumlah besar, sehingga penyediaan bibit dalam jumlah yang besar tidak memerlukan banyak tanaman induk.

1.2       Tujuan

1.      Untuk mengetahui pembuatan media kultur jaringan

2.      Untuk mengenal dan mengoperasikan alat-alat yang digunakan dalam praktikum kultur jaringan

3.      Untuk mengetahui ilmu tentang praktikum kultur jaringan

4.      Untuk mengetahui teknik sterilisasi eksplan, teknik penanaman eksplan, teknik subkultur eksplan, dan teknik aklimatisasi.

II.       TINJAUAN PUSTAKA

2.1       Pembuatan Larutan Induk

Larutan induk adalah larutan yang akan dijadikan bahan dasar media tanam in vitro dimana terdiri dari larutan induk senyawa makro, larutan induk senyawa mikro, larutan induk senyawa besi dan unsur‑unsur vitamin serta zat pengatur tumbuh. Tujuannya adalah mempelajari cara pembuatan larutan induk, berdasarkan kelompok senyawa masing‑masing dan ketersediaan larutan induk akan mempermudah dalam pembuatan media in vitro (Anonymousᵇ, 2013).

2.2       Pembuatan Media Kultur (Jenis media Murashige and Skoog)

Media merupakan faktor penentu dalam perbanyakan dengan kultur jaringan. Komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon.  Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan. Media yang digunakan juga harus disterilkan dengan cara memanaskannya dengan autoklaf. Media Murashige dan Skoog (MS) sering digunakan karena cukup memenuhi unsur hara makro, mikro dan vitamin untuk pertumbuhan tanaman. Nutrien yang tersedia di media berguna untuk metabolisme, dan vitamin pada media dibutuhkan oleh organisme dalam jumlah sedikit untuk regulasi (Marlina, 2004). Pada media MS, tidak terdapat zat pengatur tumbuh (ZPT) oleh karena itu ZPT ditambahkan pada media (eksogen).

2.3       Isolasi Dan Inokulasl Explant

2.3.1     Inisiasi

Tujuan utama dari propagasi secara in-vitro tahap ini adalah pembuatan kultur dari eksplan yang bebas mikroorganisme serta inisiasi pertumbuhan baru (Gunawan, 1987). Ditambahkan pula bahwa pada tahap ini mengusahakan kultur yang aseptik atau aksenik. Aseptik berarti bebas dari mikroorganisme, sedangkan aksenik berarti bebas dari mikroorganisme yang tidak diinginkan. Dalam tahap ini juga diharapkan bahwa eksplan yang dikulturkan akan menginisiasi pertumbuhan baru, sehingga akan memungkinkan dilakukannya pemilihan bagian tanaman yang tumbuhnya paling kuat,untuk perbanyakan (multiplikasi) pada kultur tahap selanjutnya (Khan IA, 1988).

2.3.2        Sterilisasi

Sterilisasi adalah bahwa segala kegiatan dalam kultur jaringan harus dilakukan di tempat yang steril, yaitu di laminar flow dan menggunakan alat-alat yang juga steril (Gunawan, 1987). Sterilisasi juga dilakukan terhadap peralatan, yaitu menggunakan etanol yang disemprotkan secara merata pada peralatan yang digunakan. Teknisi yang melakukan kultur jaringan juga harus steril.

2.3.3        Multiplikasi

Tahap ini bertujuan untuk menggandakan propagul atau bahan tanaman yang diperbanyak seperti tunas atau embrio, serta memeliharanya dalam keadaan tertentu sehingga sewaktu-waktu bisa dilanjutkan untuk tahap berikutnya (Lyndon RF, 1990). Perbanyakan dapat dilakukan dengan cara merangsang terjadinya pertumbuhan tunas cabang dan percabangan aksiler atau merangsang terbentuknya tunas pucuk tanaman secara adventif, baik secara langsung maupun melalui induksi kalus terlebih dahulu. Seperti halnya dalam kultur fase inisiasi, di dalam media harus terkandung mineral, gula, vitamin, dan hormon dengan perbandingan yang dibutuhkan secara tepat (Soomro, 2003). Hormon yang digunakan untuk merangsang pembentukan tunas tersebut berasal dari golongan sitokinin seperti BAP, 2-iP, kinetin, atau thidiadzuron (TDZ).

2.3.4        Pengakaran

Pengakaran adalah fase dimana eksplan akan menunjukkan adanya pertumbuhan akar yang menandai bahwa proses kultur jaringan yang dilakukan mulai berjalan dengan baik. Pengamatan dilakukan setiap hari untuk melihat pertumbuhan dan perkembangan akar serta untuk melihat adanya kontaminasi oleh bakteri ataupun jamur. Eksplan yang terkontaminasi akan menunjukkan gejala seperti berwarna putih atau biru (disebabkan jamur) atau busuk (disebabkan bakteri).

2.4       Aklimatisasi

Tahap aklimatisasi planlet merupakan salah satu tahap kritis yang sering menjadi kendala dalam produksi bibit secara masal. Pada tahap ini, planlet atau tunas mikro dipindahkan ke lingkungan di luar botol seperti rumah kaca , rumah plastik, atau screen house proses ini disebut aklimatisasi (Pierik, 1999). Aklimatisasi adalah proses pengkondisian planlet atau tunas mikro (jika pengakaran dilakukan secara ex-vitro) di lingkungan baru yang aseptik di luar botol, dengan media tanah, atau pakis sehingga planlet dapat bertahan dan terus menjadi bibit yang siap ditanam di lapangan. Prosedur pembiakan dengan kultur jaringan baru bisa dikatakan berhasil jika planlet dapat diaklimatisasi ke kondisi eksternal dengan keberhasilan yang tinggi.

III.        MATERI PEMBAHASAN

3.1  Pembuatan Media Perbanyakan (Inokulasi/Penanaman)

3.1.1   Metode (Tahap Pelaksanaan/Cara Kerja)

3.1.2   Hasil Dan Pembahasan

Dalam praktikum yang kami lakukan, untuk pembuatan media yang kami lakukan yaitu menyiapkan larutan induk yang telah dihitung kebutuhannya (makro, mikro, vitamin, Fe EDTA dan ZPT). Mencampur bahan dasar (larutan induk) diatas ke dalam beaker glass, ditambah sucrosa dan aquades steril hingga volume media yang telah dihitung. Mengukur pH 5,8; apabila dalam pengukuran pH kurang dari 5,8 maka ditambahkan (larutan basa) NaOH, sedangkan bila larutan media memiliki pH lebih dari 5,8 maka tambahkan (larutan asam) larutan HCI hingga media yang dibuat memiliki keasaman yang dikehendaki (5,8). Menambahkan agar ke dalam media, diaduk hingga homogen dan dipanaskan sampai agar terlarut. Siapkan botol/tabung kultur beserta tutupnya lalu tuangkan ke dalam botol masing‑masing 15 ml media setiap botol dan tutup dengan segera. Sterilkan dengan autoclave menggunakan tekanan 15 psi selama 25 menit dengan suhu 121 C. Setelah keluar dari autoklave segera masukkan ke dalam ruang simpan untuk menekan kontaminasi media.

Hal ini hampir sama dengan literatur, dimana dalam literatur disebutkan komposisi media yang digunakan tergantung dengan jenis tanaman yang akan diperbanyak. Media yang digunakan biasanya terdiri dari garam mineral, vitamin, dan hormon. Selain itu, diperlukan juga bahan tambahan seperti agar, gula, dan lain-lain. Zat pengatur tumbuh (hormon) yang ditambahkan juga bervariasi, baik jenisnya maupun jumlahnya, tergantung dengan tujuan dari kultur jaringan yang dilakukan (Gunawan, 1987). Salah satu medium untuk kultur jaringan tanaman adalah media Murashige dan Skoog (MS). Keistimewaan media MS adalah kandungan nitrat,kalium,dan amoniumnya yang tinggi.

3.2  Penanaman/Isolasi Dan Inokulasi Eksplan

3.2.1   Metode (Tahap Pelaksanaan/Cara Kerja)

3.2.2   Hasil Dan Pembahasan

Pada saat praktikum kultur jaringan bagian penanaman dan inokulasi eksplan, eksplan atau tanaman yang digunakan adalah mawar (mawar 1-7). Secara keseluruhan, eksplan yang hidup persentasenya yaitu 9% dengan sisanya 91% eksplan mati. Untuk eksplan mawar yang saya gunakan yaitu terlihat pada mawar 1. Pada mawar yang saya amati tidak terlihat tunas yang tumbuh namun juga tidak terlihat ada jamur maupun adanya kontaminasi. Hal ini mungkin saja karena eksplan mengalami pertumbuhan yang terhambat atau tidak dapat tumbuh normal. Jika dibandingkan dengan mawar 2 dan 7 dapat dikatakan mawar 7 memiliki pertumbuhan yang kurang baik karena pada mawar 2 dan 7 terlihat adanya tunas yang muncul. Namun, jika dibandingkan dengan mawar 3,4,5,6,8 mawar 7 dikatakan lebih baik karena pada mawar 3,4,5,6,8 terlihat adanya kontaminasi serta adanya jamur yang tumbuh didalam media tanam meskipun sama-sama tidak terlihat tunas yang tumbuh.

Mawar 1	Mawar 2	Mawar 3	Mawar 4
Mawar 5	Mawar 6	Mawar 7	Mawar 8

Untuk mawar 1 persentase eksplan hidup 0%, untuk inisiasi tunas persentasenya 0%, inisiasi akar 0%, dan persentase kontaminasi 0% karena dalam eksplan tidak terlihat tanaman terkontaminasi, namun tanaman tidak muncul tunas. Kemudian untuk mawar 2 persentase eksplan hidup 100%, untuk inisiasi tunas persentasenya 90% karena terlihat tunas muncul 2, inisiasi akar 0%, dan persentase kontaminasi 0%. Untuk mawar 3 persentase eksplan hidup 0%, untuk inisiasi tunas persentasenya 0%, inisiasi akar 0%, dan persentase kontaminasi 98% karena hampir keseluruhan media terkena jamur. Untuk mawar 4 persentase eksplan hidup 0%, untuk inisiasi tunas persentasenya 0%, inisiasi akar 0%, dan persentase kontaminasi 98% karena memang secara keseuruhan telah terserang jamur. Untuk mawar 5 persentase eksplan hidup 0%, untuk inisiasi tunas persentasenya 0%, inisiasi akar 0%, dan persentase kontaminasi 45% karena terlihat ada dua bulatan besar jamur yang tumbuh. Untuk mawar 6 persentase eksplan hidup 0%, untuk inisiasi tunas persentasenya 0%, inisiasi akar 0%, dan persentase kontaminasi 80% karena terlihat terdapat jamur berwarna putih serta bulatan hitan-hitam. Untuk mawar 7 persentase eksplan hidup 100%, untuk inisiasi tunas persentasenya 90%, inisiasi akar 0%, dan persentase kontaminasi 0% karena terlihat terdapat tunas yang muncul sebanyak 3. Untuk mawar 8 persentase eksplan hidup 0%, untuk inisiasi tunas persentasenya 0%, inisiasi akar 0%, dan persentase kontaminasi 99% karena hampir keseluruhan media tertutup oleh jamur yang tumbuh.

Menurut literatur masalah yang sering dihadapi pada kultur jaringan adalah terjadinya pencokelatan atau penghitaman bagian eksplan (browning). Hal ini disebabkan oleh senyawa fenol yang timbul akibat stress mekanik yang timbul akibat pelukaan pada waktu proses isolasi eksplan dari tanaman induk. Senyawa fenol tersebut bersifat toksik, menghambat pertumbuhan atau bahkan dapat mematikan jaringan eksplan (Hameed, 2006).

3.3       Pembuatan Stok Media MS

Dalam membuat stok media MS diperlukan larutan induk yang akan dijadikan bahan dasar media tanam in vitro. Larutan induk terdiri dari larutan induk senyawa makro, larutan induk senyawa mikro, larutan induk senyawa besi (Fe) dan unsur-unsur vitamin serta zat pengatur tumbuh. Bahan dasar media tanam in vitro tersebut merupakan bahan-bahan yang digunakan pada praktikum kultur jaringan bagian pembuatan larutan media. Untuk alat-alat yang digunakan yaitu timbangan analitik, spatula, beaker glas, cup kertas, sendok plastik, corong kaca, labu ukur, botol penyimpanan larutan, alumunium foil (sebagai penutup botol), akuades dan kertas tissue.

3.4       Aklimatisasi

Dalam proses perbanyakan tanaman secara kultur jaringan, tahap aklimatisasi planlet merupakan salah satu tahap kritis yang sering menjadi kendala dalam produksi bibit secara masal. Aklimatisasi adalah proses pengkondisian planlet atau tunas mikro (jika pengakaran dilakukan secara ex-vitro) di lingkungan baru yang aseptik di luar botol, dengan media tanah, atau pakis sehingga planlet dapat bertahan dan terus menjadi bibit yang siap ditanam di lapangan. Pemindahan dilakukan secara hati-hati dan bertahap, yaitu dengan memberikan sungkup. Sungkup digunakan untuk melindungi bibit dari udara luar dan serangan hama penyakit karena bibit hasil kultur jaringan sangat rentan terhadap serangan hama penyakit dan udara luar. Setelah bibit mampu beradaptasi dengan lingkungan barunya maka secara bertahap sungkup dilepaskan dan pemeliharaan bibit dilakukan dengan cara yang sama dengan pemeliharaan bibit generatif. Dalam melakukan kegiatan praktikum aklimatisasi ini, diperlukan alat dan bahan. Alat tersebut yaitu bak plastik ukuran 30 x 20 x 15 cm (bawahnya dilubangi), cetok, plastik penutup, sprayer, pinset, gunting, hand sprayer, dan tali rafia. Sedangkan bahan tersebut yaitu plantet (tanaman kecil yang lengkap), media aklimatisasi seperti bahan organik+pasir+tanah (2:2:1), fungsida dan air. Prosedur pembiakan dengan kultur jaringan baru bisa dikatakan berhasil jika planlet dapat diaklimatisasi ke kondisi eksternal dengan keberhasilan yang tinggi.

IV.    KESIMPULAN

Sebelum melakukan kultur jaringan untuk suatu tanaman, kegiatan yang pertama harus dilakukan adalah memilih bahan induk yang akan diperbanyak. Tanaman tersebut harus jelas jenis, spesies, dan varietasnya serta harus sehat dan bebas dari hama dan penyakit. Tanaman indukan sumber eksplan tersebut harus dikondisikan dan dipersiapkan secara khusus di rumah kaca atau greenhouse agar eksplan yang akan dikulturkan sehat dan dapat tumbuh baik serta bebas dari sumber kontaminan pada waktu dikulturkan secara in-vitro. Lingkungan tanaman induk yang lebih higienis dan bersih dapat meningkatkan kualitas eksplan.

Metode kultur jaringan dikembangkan untuk membantu memperbanyak tanaman, khususnya untuk tanaman yang sulit dikembangbiakkan secara generatif. Bibit yang dihasilkan dari kultur jaringan mempunyai beberapa keunggulan, antara lain: mempunyai sifat yang identik dengan induknya, dapat diperbanyak dalam jumlah yang besar sehingga  tidak terlalu membutuhkan tempat yang luas, mampu menghasilkan bibit dengan jumlah besar dalam waktu yang singkat, kesehatan dan mutu bibit lebih terjamin, kecepatan tumbuh bibit lebih cepat dibandingkan dengan perbanyakan konvensional. Tahapan yang dilakukan dalam perbanyakan tanaman dengan teknik kultur jaringan adalah pembuatan media, Inisiasi, Sterilisasi, Multiplikasi, Pengakaran, dan Aklimatisasi.

Pada praktikum kultur jaringan ini saya mendapat bagian untuk tanaman mawar, dari hasil praktikum yang telah dilakukan total keseluruhan tanaman yang hidup yaitu 9% dan sisanya 91% mati. Untuk eksplan mawar yang saya gunakan yaitu terlihat pada mawar 1. Pada mawar yang saya amati tidak terlihat tunas yang tumbuh namun juga tidak terlihat ada jamur maupun adanya kontaminasi. Hal ini mungkin saja karena eksplan mengalami pertumbuhan yang terhambat atau tidak dapat tumbuh normal.

DAFTAR PUSTAKA

Anonymousª, 2013. Bioteknologi dengan kultur jaringan dalam http:// www.plengdut.com /2012/10/ bioteknologi-dengan-menggunakan_857.html/ diakses tanggal 31 mei 2013

Anonymousᵇ, 2013.Kultur Jaringan dalam http://blogs.unpad.ac.id/yunmyu/?tag=kultur-jaringan-alternatif-bibit-unggul/ diakses tanggal 31 mei 2013

Gunawan LW. 1987. Teknik Kultur Jaringan. Bogor: Pusat Antar Universitas Bioteknologi, Institut Pertanian Bogor. Hal. 252.

Hameed N, Shabbir A, Ali A, Bajwa R. 2006. In vitro micropropagation of disease free rose (Rosa indica L.). Mycopath 4:35-38

Khan IA, Shaw JJ. 1988. Biotechnology in Agriculture. Punjab. Agric. Res. Coordination Board Faisalabad, Pakistan. pp. 2.

Lyndon RF. 1990. Plant Development; The Cellular Basis. London: Unwin Hyman Ltd. Hal. 37-41.

Marlina N. 2004. Teknik modifikasi media Murashige dan Skoog (MS) untuk konservasi in vitro. Buletin Teknik Pertanian 9(1):4-6.

Pierik RLM. 1999. In vitro culture of higher plants. 4th Edition. USA: Kluwer Academic Publishers. Hal. 16-27

Soomro R, Yasmin S, Aleem R. 2003. In vitro propagation of Rosa indica. Pakistan Journal of Biological Sciences 6(9):826-830.